Doktorsvörn í líf- og læknavísindum - Andrea García-Llorca

Þriðjudaginn 18. febrúar ver Andrea García-Llorca doktorsritgerð sína í líf- og læknavísindum við Læknadeild Háskóla Íslands. Ritgerðin ber heitið: Umritunarþátturinn microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) og hlutverk hans í starfsemi augna músa. The role of the microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) in mouse eye function.

Andmælendur eru dr. Kai Kaarniranta, prófessor við Háskólann í Kuopio, Finnlandi og dr. Hans Tómas Björnsson, prófessor við Læknadeild Háskóla Íslands. 

Umsjónarkennari var dr. Þór Eysteinsson og meðleiðbeinandi var dr. Margrét Helga Ögmundsdóttir. Auk þeirra sátu í doktorsnefnd dr. Eiríkur Steingrímsson, prófessor, dr. Jóna Freysdóttir, prófessor og dr. Þórarinn Guðjónsson, prófessor.

Engilbert Sigurðsson, prófessor og forseti Læknadeildar Háskóla Íslands, stjórnar athöfninni sem fer fram í Hátíðasal Háskóla Íslands og hefst kl. 13.00.

Ágrip af rannsókn

Umritunarþátturinn microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) er mikilvægur fyrir eðlilega þroskun og starfsemi litþekju (retinal pigment epithelium, RPE) augans og ljósnema í músum. Stökkbreytingar í geni þessu sem skerða starfsemi þess geta valdið minnkun litmyndunar í augum, vanþroskun augnanna (microphthalmiu) og blindu. Sjálfsát (autophagy) er mikilvægt hreinsunarferli í frumum sem viðheldur samvægi (homeostasis) í litþekju. Óeðlilegt eða skert sjálfsát er þáttur í aldursháðri hrörnun miðgrófar (AMD) í mönnum. Markmið þessarar rannsóknar var að greina áhrif tiltekinna stökkbreytinga í Mitf geninu á byggingu og starfsemi sjónhimnu og litþekju augans, og athuga hvort Mitf stýrir sjálfsáti í litþekjufrumum í músum. Eftirfarandi stökkbreytingar voru skoðaðar í þessari rannsókn: Mitfmi-vga9/+, Mitfmi-enu22(398)/Mitfmi-enu22(398), MitfMi-Wh/+, MitfMi-Wh/Mitfmi, MitfK243R;Tyr::Cre og mýs af villigerð (C5BL/6J) sem viðmið. Minnkuð litmyndun var greinileg í augnbotnum allra stökkbreyttu dýranna. Fullvaxta Mitfmi-vga9/+ and Mitfmi-enu22(398)/Mitfmi-enu22(398)  mýs eru með augu af eðlilegri stærð og sjónhimnur sem starfa eðlilega. MitfMi-Wh/+ og MitfMi-Wh/Mitfmi mýs sýndu skýr merki alvarlegrar sjónhimnuhrörnunar við 3 mánaða aldur. OCT sneiðmyndir frá 1 og 3 mánaða gömlum MitfK243R/K243R; Tyr::Cre músum sýna að sum svæði sjónhimnu þeirra hafa litþekju, ljósnema og frumulög taugafrumna óbreytt, meðan í aðliggjandi svæðum er hrörnun þessara frumna. Við eins árs aldur eru litþekja, ljósnemalag og ytri frumulög sjónhimnu horfin í MitfK243R/K243R; Tyr::Cre músum. Magnmæling með Western-blettun sýndi að lípíð-fært LC3B-II, sem er notað sem merki fyrir sjálfsát, var marktækt aukið í ómeðhöndluðum litþekjufrumum úr Mitfmi-vga9/+ músum.  Enn fremur sást í rafeindasmásjármyndum að Mitfmi-vga9/+ mýs hafa aukinn fjölda sjálfsátsagna (autolysosomes) í litþekju borið saman við augu villigerðarmúsa við þriggja mánaða aldur. Þetta bendir til óeðlilegs sjálfsáts í litþekju Mitfmi-vga9/+ músa með uppsöfnun óvirkra sjálfsátsagna. Niðurstöðurnar sýna að Mitf stökkbreytingarnar hafa áhrif á starfsemi sjónhimnu, byggingu taugavefs sjónhimnu og á litþekju í ólíkum mæli eftir því um hvers konar stökkbreytingu er að ræða og að genið gegnir lykilhlutverki í að stýra litdreifingu í augnbotnum músa.  Mýs með „skilyrtu“ MitfK243R; Tyr::Cre stökkbreytinguna er hugsanlega fyrsta músalíkanið af hægvaxandi, svæðisbundinni hrörnun sjónhimnu (geographic atrophy, GA).  Að auki kom í ljós að Mitf genið gegnir mikilvægu hlutverki í sjálfsáti í litþekju músa.  Þetta verkefni hefur varpað ljósi á hlutverk Mitf í starfsemi augans og lagt grunn að nýju dýra-líkani af GA.

Abstract

The mouse microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) gene is crucial for the normal development and function of the retinal pigment epithelium (RPE) in mice. Loss of function mutations in this gene can cause ocular hypopigmentation, microphthalmia and blindness. The cellular clearance pathway autophagy is important for the homeostasis of RPE cells. Impaired or dysfunctional autophagy has been associated with age-related macular degeneration (AMD). The purpose of this study was to characterize the effects of specific mutations in the Mitf gene on the morphology and function of the retina and RPE and to determine whether Mitf regulates autophagy in mouse primary RPE cells. The following Mitf mutations were used: Mitfmi-vga9/+, Mitfmi-enu22(398)/Mitfmi-enu22(398), MitfMi-Wh/+, MitfMi-Wh/Mitfmi, MitfK243R;Tyr::Cre and wild type (C5BL/6J) mice as a control. All the Mitf mutant mice examined revealed some hypopigmentation in their fundi, varying in degree. Mitfmi-vga9/+ and Mitfmi-enu22(398)/Mitfmi-enu22(398) mice have normal eye size and external structures and normally functioning retinas. In contrast, MitfMi-Wh/+ and MitfMi-Wh/Mitfmi showed clear evidence of severe retinal degeneration at 3 months of age. Interestingly, MitfK243R/K243R; Tyr::Cre mice showed a different eye color on the right eye, whereas the left eye showed a brighter appearance. OCT images from 1 and 3 month old MitfK243R/K243R;Tyr::Cre mice demonstrated geographic areas while other regions were normal. However, at one year of age the RPE, photoreceptor and outer retina layers were missing from the eyes of MitfK243R/K243R;Tyr::Cre mice.

Immunoblotting analysis showed that the autophagy marker LC3B-II was significantly increased in untreated Mitfmi-vga9/+ mouse primary RPE cells, suggesting that autophagy flux is affected in these cells. Furthermore, electron micrographs deomonstrated that Mitfmi-vga9/+ RPE cells have an increased number of autolysosomes (ALs) compared to 3 month old wild type mice, suggesting that dysfunctional autophagy in the Mitfmi-vga9/+  RPE leads to an accumulation of inactive ALs.  The results show that the Mitf gene has an impact on retinal function, the morphology of the neuroretina and the RPE to a varying degree, depending on the mutations involved and plays a fundamental role in regulating the fundus pigmentation in mice. We have found that mice with the MitfK243R conditional mutation driven by the Tyr::Cre driver may be the first mouse model of slow progressive retinal geographic atrophy (GA). In addition, we have shown that Mitf plays an important role in autophagy in mice. This work has shed light on the role of Mitf in eye function and built a foundation for a novel model of GA. 

Um doktorsefnið

Andrea García-Llorca er fædd í Alicante á Spáni árið 1987. Hún lauk BS-prófi í líffræði við IE Universidad í Segovia á Spáni árið 2005, og BS-prófi í lífefnafræði við Universidad de Salamanca á Spáni árið 2009.  Hún lauk meistaraprófi í kennslufræðum á framhaldsnámsstigi, með sérhæfingu í líffræði og jarðfræði frá Universidad de Salamanca árið 2013. Í lok ársins 2014 hóf Andrea García-Llorca doktorsnám við Lífeðlisfræðistofnun Læknadeildar HÍ.