Meistarafyrirlestur í lífefnafræði - Arnór Freyr Sævarsson

Meistaranemi: Arnór Freyr Sævarsson
Heiti verkefnis: Hitastöðuleikaáhrif vegna prólína í yfirborðslykkjum á kuldaaðlagaða subtilasanum VPR og fylgst með hreyfanleika hvarfstöðvar með EPR
___________________________________________
Deild: Raunvísindadeild 
Leiðbeinandi: Magnús Már Kristjánsson, prófessor

Prófdómari: Ólafur Þór Magnússon, deCode

Ágrip

Fyrri hluti verkefnisins snérist um að skilja hitastöðugleikaáhrif prólína í yfirborðslykkjum á kuldaaðlagaða serín próteasann VPR úr Vibrio sp. (PA-44). Stökkbreytingarnar N3P, I5P, N238P og T265P sem voru framkvæmdar á VPR voru valdar samkvæmt prólínum sem eru til staðar í samstofna hitastöðuga próteasanum aqualysin I (AQUI) úr Thermus aquaticus.
Einföldu prólínafbrigðin N3P og I5P stöðguðu ensímið mest, þar á eftir kom T265P með minni stöðgun, en N238P sýndi minni hitastöðugleika miðað við villigerðina VPRΔC.
Tvöföldu (N3P/I5P), þreföldu (N3P/I5P/N238P og N3P/I5P/T265P) og fjórföldu (N3P/I5P/N238P/T265P) prólínafbrigðin juku öll stöðugleika meira í samsettu prólínafbrigðunum en sem svaraði til stöðgunar vegna hverrar stakar prólín breytingar í eiföldu stökkbrigðunum. Þannig að stöðgandi áhrifs hverrar prólín stökkbreytingar voru voru samleggjanleg og unnu því saman við að stögða ensímið. Afbrigðin sem sýndu mestu stöðgun voru N3P/I5P/T265P og N3P/I5P/N238P/T265P með í kringum 8-9°C aukningu í T50% og Tm. Öll afbrigðin höfðu svipaða virkni og villigerðin þannig að allar stökkbreytingarnar, fyrir utan N238P, jóku stöðugleika án þess að hafa áhrif á virkni.

Markmið seinni hluta verkefnisins var að athuga mögulegt samband milli virkni og hreyfanleika byggingar kuldavirka próteasans VPR og hitaþolna próteasans AQUI. Virku serín í hvarfstöðinni var breytt í cystein með efnafræðilegum aðferðum og svo spunamerkt.
Hreyfanleiki spunamerkisins í hvarfstöð ensímanna var svo greindur með rafeindaspunagreiningu (EPR). Útlit EPR rófana og reiknaði hlutfallslegi hreyfanleikaþátturinn Ms benti til þess að hreyfanleiki spunamerkjanna í hvarfstöð VPRΔC
og AQUI wt væri sá sami. Út frá þessu er svo gróflega hægt að áætla að hreyfanleikinn og nálægt umhverfi í kringum spunamerkta virka serínið, sem hefur verið breytt í cystein, sé svipað fyrir þessi tvö ensím. Þetta samræmist ekki þeirri hugmynd að kuldavirkni feli í sér aukinn sveigjanleika og hreyfanleika í hvarfstöð. Spunamerkið í hvarfstöð AQUI D98S, sem er með aukna hverfitölu (kcat) og hvarfefnissækni (KM), hafði mun meiri hreyfanleika en
villigerð samkvæmt EPR. Þetta gæti bent til aukningar í hreyfingu eða breytingu í nálægu umhverfi virka serínins í AQUI D98S miðað við AQUI wt.